朱載堉受父親朱厚烷影響，自幼喜好音律、數學。早年師從舅父學天文、算術，十一歲被封為世子，十五歲時因父親被誣告軟禁，他也被剝奪世子身份，此後在宮門外築土屋獨居十九年。
在這19年裡，朱載堉將世間事置身度外，一心撲在樂律、算學上，取得了許多重要成就。
他自己動手做了一個橫跨81檔的特大算盤，在這個“計算機”上開平方、開立方，求出了十二平均律的準確參數，並設計、製造出弦準（世界上第一架定音樂器）和律管。他創建的“十二平均律”理論被廣泛應用在世界各國的鍵盤樂器（包括鋼琴）上，西方普遍認為是“標準調音”“標準的西方音律”，朱載堉也被譽為“鋼琴理論的鼻祖”。
朱載堉在這期間還完成了《瑟譜》十卷的撰寫，在《瑟譜小序》中，他自稱“狂生”，署名“山陽酒狂仙客”。
此外，他謝絕了他人提的婚事，隻與關西名僧鬆穀講經闡佛。
朱載堉確定標準黍粒的事跡。在中國古代，音律學與度量衡互相關聯，而確定一尺的長度需要以農作物“黍”的排列法來確定。
為了尋求標準的黍粒，朱載堉查經問典、遍尋古籍，調查黍的起源、生長環境、種植範圍等農業資料。大約在1567至1593年間，他先後三次來到上黨地區高平羊頭山實地考察。
羊頭山是炎帝文化最為集中的區域，是神農當年辨五穀、嘗百草、創耒耜、立曆法的地方，黍就是神農在此地培植的。
朱載堉第一次上羊頭山是在30歲左右，當時他完成了《瑟譜》，開始樂律研究，而古傳神農嘗百草、辨五穀，他翻閱北魏《風土記》時發現黍的優質產地在炎帝故裡山西高平羊頭山的井子坪。
後來嘉靖皇帝駕崩，隆慶帝即位，朱載堉父子奉詔恢複爵位，他在去北京朝賀返回懷慶府的途中繞道長子，去攀登羊頭山，初步了解了基本狀況。
第二次上羊頭山是在婚後。35歲的朱載堉婚後從河內縣的神農山出發，沿著神農故道北上進入羊頭山，在黍收獲的季節進行了十多天的考察研究，了解到黍的三種類型，並選中了其中一種。
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他從羊頭山帶回黍種，在九峰山丹水河邊買田試種，經過數年選種連種，終於培育出標準的黍粒。他把標準的黍粒橫排100粒製成“橫黍尺”，把黃鐘律尺由九進製變成十進製，最終確定一律尺之長為2548厘米，這為他發明“十二平均律”打開了計算通道。
第三次上羊頭山是在他隱居九峰山以後，重新審定《律呂精義》等著作，準備編纂《樂律全書》期間。這次他進一步驗證了所選的黍種，還詳細考察了羊頭山神農曆史文化遺跡，準確完整地記錄了唐代重修清華寺的碑文，使後人對始祖炎帝活動於羊頭山的史實有了清晰明確的認識。
最終他寫出了著名的考察散文《羊頭山新記》，確認了莊裡村炎帝陵的真實性，並指出羊頭山因神農播五穀而成為天下名區。
這些經曆展現了朱載堉堅韌不拔的意誌和對學術研究的執著追求，他在艱苦的環境中取得了卓越的成就，為中國古代音樂、數學等領域的發展做出了重要貢獻。
世宗死後，穆宗即位大赦天下，朱厚烷恢複爵位，朱載堉恢複世子身份，並回到鄭王府。他與朱厚烷合作撰寫《操縵古樂譜》《旋宮》等譜。著有《律曆融通·序》《律學新說·序》。
萬曆十九年（1591年），朱厚烷去世，五十六歲的朱載堉連續上疏，要求讓出王位，經過十五年、七次上疏後獲得批準。
朱載堉多次要求去掉皇位（放棄承襲王位）的原因主要是他對科學研究的熱愛以及個人的誌趣和追求。他誌不在官場和富貴，而是醉心於學術研究。在父親朱厚烷被軟禁期間，他也經曆了艱苦的生活，這使他更加看淡名利。此外，朱載堉可能認為放棄王位可以讓他更自由地進行研究，不受宮廷事務和權力鬥爭的束縛。
朱厚烷去世後，朱載堉上疏放棄承襲王位，有司認為可讓朱載堉的兒子朱翊錫承襲王位，但朱載堉仍不答應，十五年裡七次上疏放棄襲爵，萬曆無奈隻好答應，令載堉及翊錫以世子世孫祿終其身，子孫仍封東垣王。讓爵之後，朱載堉自稱道人。
他搬到懷慶府城外，繼續寫作。萬曆三十四年“進律書奏疏”，明神宗賜他建“讓國高風”玉音坊。萬曆三十八年完成《律呂正論》；同年完成《嘉量算經》上卷，卷末記載自序。
萬曆三十九年（1611年）朱載堉逝世，終年七十六歲，明神宗賜諡號“端清”，次年三月廿六日，葬於九峰山。
朱載堉所處的時代，數學、天文曆法等學科也取得了一定的進步，為他進行音律學的深入研究了有利的條件和方法。完成了十二平均律數理方法和全部理論的創建，在當時世界上居於領先地位。
他稱十二平均律為“新法密律”，用勾股術、開平方術、開立方術等數學方法，計算出十二律每律的等比數，其數學表達史精確到小數點後24為有效數字，計算出的密率為10。他還首創出有彆於魏晉荀勖所創“同徑管律”的“異徑管律”管口校正法。
製造樂器和考證古樂器製造了世界上第一架定音樂器弦準、十二平均律律管，考證了篪、鐘、磬、瑟、笙等古樂器的諸多方麵，為樂器史研究了參考材料。
提出“舞學”概念並創編舞譜《樂律全書》保存了許多樂譜和舞譜，他首次提出“舞學”概念，將律學、樂學和舞學區分為三個獨立的學科。其擬古舞譜極詳儘地記下古代舞蹈的舞法、描繪了舞圖和舞譜，還提出包括十大方麵內容的舞學大綱，他的“天下太平”舞譜被視為今天團體操的先河。
天文曆法方麵著有曆學著作《律曆融通》，編製《黃鐘曆》和《聖壽萬年曆》，求出計算回歸年長度的公式，算出1554年的長度值與現代高科技測量結果僅差17秒鐘；1581年差21秒鐘，還是我國第一個精確計算出北京地理位置的人；
文學方麵，其散曲集《醒世詞》存小令73首，各領域著述多達百萬字。是第一個精確計算出北京地理位置（北緯39°56′，東經116°101novel.com′）的人；
測出北京的地磁偏角為4°48′，留下中國曆史上第一個磁偏角的定量資料；發明用泥球塗以白粉懸於暗室，然後以燈光照射，演示“弦望晦朔之象”和日食的情景，總結出日食隨觀測地點不同有不同食分和“日大而月小”的科學結論。
數學和算術方麵是世界上最早解答已知等比數列的首項、末項和項數，及求解其它各項方法的人；最早變九進位為十進位，找到不同進位製的小數換算方法；最早運用珠算進行開平方、開立方、開高次方運算。著有《算學新說》《嘉量算經》《圓方勾股圖解》等數學著作。
計量學方麵確定古人所說的尺長，測定水銀密度，確定量製標準，從理論上辯證說明“同律度量衡”的關係，其撰寫的《律呂精義》卷十中有計量學內容。
文學方麵以俚俗的韻語寫成散曲《醒世詞》存七十三首，今存世二十首，作品語言通俗、質樸，諷刺色彩濃鬱。
朱載堉在數學、天文學、聲學、樂律學、樂器製造和舞學等多個領域均有很高造詣，他的著作《樂律全書》，這是其所著14部著作的合集。
朱載堉的“新法密率”理論早於西方，關鍵數據被傳教士帶到歐洲後引起學術界震驚，影響了世界音化史的進程，他也因此被人們譽為“科學和藝術的巨星”“東方文藝複興史的人物”，並被聯合國教科文組織公布為世界文化名人，從18世紀中期起，他的名字在西方被尊稱為“王子載堉”。
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